PCR – Reaktionsschritte im Thermocycler

Im zweiten Abschitt des Blog-Beitrags Prinzip der PCR –  Polymerasekettenreaktion wird der weitestgehend automatisch ablaufende, zentrale Prozess im Thermocycler beschrieben. Ein Bild sagt mehr als tausend Worte, findet nicht nur ein User (»Kommentar). Wir können uns dem nur anschließen und haben den Ablauf mit einfachen, auf das Wesentliche beschränkten Grafiken veranschaulicht

Der Beitrag PCR in der Laborpraxis führt im zweiten Abschnitt Automatischer Ablauf im Thermo-Cycler die Schritte der PCR anwenderseitig auf und soll hier nochmal mit Grafiken veranschaulicht und besser verständlich werden:

Virus-RNA-Strang

In den zahlreichen kleinen Reagenzgefäßen der Platte befindet sich die idR. vorher aufbereitete Virus-RNA und der als fertiges Kit erhältliche Mix an Subtanzen für den immer wiederholten Hauptschritt des Prozesses.
Darunter insbesondere die Primer, das sind kurze Nukleotidketten, die als Startersequenzen für die Vervielfältigung dienen.

Vor den vielen Vermehrungszyklen wird zunächst der Virus-RNA-Einzelstrang in einen DNA-Doppelstrang umgeschrieben. Dazu dockt der RNA-Primer am gewünschten Genabschnitt des Virus an…

… und ermöglicht dem Enzym „Reserve Transkriptase“ dort anzusetzen und den einfachen Strang zum DNA-Doppelstrang zu ergänzen.

Temperatur-Zyklen

Der Zyklus startet, indem der Automat die Lösung nun kräftig auf über 90 °C erhitzt, um den eben synthetisierten Virus-Doppel-DANN wieder in zwei Einzelstränge aufzuspalten.

Es soll ein ganz bestimmter Ausschnitt mit Virus-Genen vervielfältig werden. Zwei weitere Primer legen sich nun an die Einzelstränge je an einen Endpunkt an.

In der Lösung befinden sich auch die vier Basis-Nukleotide jeder DNA. Das ebenfalls im Mix enthaltenen Enzym, die Polymerase, kann nun dort Virus-RNA vermehren, wo es einen angedockten Primer findet. In der Lösung befinden sich auch die vier Basis-Nukleotide jeder DNA. Von dort aus baut es die vier Nukleotide passend an die RNA-Einzelstränge an, einmal in Richtung „forward“ bzw. reverse“. So werden aus einem Doppelstrang RNA nun zwei solche verdrehte RNA-Strickleitern:

Der Automat erhitzt, die Platte mit den vielen Eppi-Röhrchen immer von neuem und kühlt sie wieder ab. Daher die Bezeichnung PCR-Cycler. Bei jedem Zyklus wird also ein einzelner RNA-Strang für das erneute Abkopieren wieder thermisch aufgespaltet und mittels Kombination aus Primer, Polymerase -Enzym und Nukleotiden wieder zur „doppelten Strickleiter“ ergänzt usw.
Dadurch werden die Covid 19-Gena vermehrt und zwar um etliche Potenzen höher als die sonstigen im Röhrchen befindlichen RNA-Stücke.

Bei diesen Zyklen wird gleichzeitig ein Farbstoff freigesetzt, der in gebundener Form ebenfalls in der Mixtur enthalten ist.

Sensoren im Automaten messen nach jedem Durchlauf die Einfärbung und wenn ein bestimmte Schwelle erreicht ist, gilt dies als Nachweis für die Virus-RNA.

Liegt ein „Positiv“-Probe vor, nimmt die Stärke der Fluoreszenz ab einer bestimmt Zyklenzahl exponentiell zu. Nach 30-40 Zyklen wird der Prozess in der Regel gestoppt: Sollte bis dahin keine Flousreszenz erkennbar sein, ist auch keine Virus-RNA im Röhrchen enthalten.

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