PCR in der Laborpraxis

Die Polymerasekettenreaktion PCR ermöglicht es, einen genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen.

In modernen Laboren läuft die PCR fast vollautomatisch ab. Sogenannte „liquid handler“ erleichtern den Umgang mit Proben, Röhrchen und Reagenzien oder übernehmen viel Schritte komplett. Thermocycler steuern die Temperatur-Profile während der Vervielfältigungs-Zyklen.

Vorbereitung Zellproben und Reagenzien

Die mit etwas längeren Wattestäbchen gewonnenen Zellproben von der Rachenwand werden in Gitterboxen angeliefert. Diese Stäbchen werden in Röhrchen mit Lysepuffer gesteckt, das Probenmaterial (aus den Abstrichen) auf diese Weise in eine Lösung überführt. Eigentlich sind es Platten mit röhrenartigen Vertiefungen, den sogenannten wells, die 0,2 – 0,5 ml Reagenzflüssigkeit aufnehmen können. Sie werden kurz Eppis nach dem Hersteller Eppendorf genannt. Üblich sind Anordnungen mit Array von z.B. 96 Stück pro Platte.

Reagenzien: Die millionenfach durchgeführten Corona-Tests verwenden vorgefertigte PCR-Mischungen, die einfach in den Tank des Liquid-Handlers gegeben werden. Niemand muss hier noch von Hand zusammenmischen. Diese Mixturen wurden z.B. in Laboren wie dem an der Berliner Charite entwickelt und sind meist nicht patentgeschützt. Sie sind als fertige Kits kommerziell erhältlich. Jeder Probe wird mit einer bestimmten Menge dieser Mischung gefüllt.

Präparation für die PCR im Liquid-Handler

Auffälligstes Bauteil dieses Pipettierautomaten ist in beweglicher Arm mit zahlreichen Spritzpipetten, der über die zahlreichen Reihen des Arrays fährt und füllt dabei die Eppis mit Reagenz nach oder saugt es aus den Mini-Becherchen ab, je nach Prozessschritt.

Liquid Handler Tecan Fluent mit Zusatz-Modulen

Details zur PCR selbst siehe auch Prinzip der PCR.

Der erste Schritt ist das Isolieren der RNA. Diese ist ähnlich aufgebaut wie die DNA, allerdings nur mit einem Strang. Die Viren werden aufgespalten, das Erbgut so freigesetzt

„Clean-up“-Zwischenschritt

Zur Trennung der RNA von den anderen gelösten Stoffen werden kleine Magnetkügelchen, die sogenannten Beads, zugegeben. Ihre Oberfläche ist so beschaffen, dass die RNA-Schnipsel daran binden. Ist die geschehen, wird ein Magnet an das Reagenzgefäß gehalten und die Kügelchen dadurch angezogen, mit ihnen eben auch die RNA-Stücke. Saugt der Automat nun die Flüssigkeit ab, bleibt konzentrierte RNA im Röhrchen zurück. Allerdings nicht ausschließlich die des Covid 19-Virus, sondern alle möglichen Fragmente menschlicher RNA.
Dieser zusätzliche Schritt wird je nach spezifischem Verfahren optional eingefügt. Es kann dadurch die Sensitivität auf das gesuchte Genmaterial leiden.

Toption Thermocycler – 96 Tubes, 0-2 ml (Quelle: Toption)

Automatischer Ablauf im Thermo-Cycler

Nun werden der so aufbereiteten Virus-RNA die Reagenzien (also der fertige Mix) für den immer wiederholten Hauptschritt des Prozesses zugegeben Darunter insbesondere die Primer, das sind kurze Nukleotidketten, die als Startersequenzen für die Vervielfältigung dienen. Vor den vielen Vermehrungszyklen wird zunächst der Virus-RNA-Einzelstrang in einen DNA-Doppelstrang umgeschrieben. Dazu dockt der RNA-Primer am gewünschten Genabschnitt des Virus an und ermöglicht dem Enzym „Reserve Transkripase“ dort anzusetzen und den einfachen Strang zum DNA-Doppelstrang zu ergänzen.

TOPTION Thermocycler – 96 Tubes, 0-2 ml

Temperatur-Zyklen

Der Zyklus startet, indem der Automat die Lösung nun kräftig auf über 90 °C erhitzt, um den eben synthetisierten Virus-Doppel-DANN wieder in zwei Einzelstränge aufzuspalten.

Es soll ein ganz bestimmter Ausschnitt mit Virus-Genen vervielfältig werden. Zwei weitere Primer legen sich nun an die Einzelstränge je an einen Endpunkt an.

In der Lösung befinden sich auch die vier Basis-Nukleotide jeder DNA. Das ebenfalls im Mix enthaltenen Enzym, die Polymerase, kann nun dort Virus-RNA vermehren, wo es einen angedockten Primer findet. In der Lösung befinden sich auch die vier Basis-Nukleotide jeder DNA. Von dort aus baut es die vier Nukleotide passend an die RNA-Einzelstränge an, einmal in Richtung „forward“ bzw. reverse“. So werden aus einem Doppelstrang RNA nun zwei solche verdrehte RNA-Strickleitern à Link auf Blog

Der Automat erhitzt, die Platte mit den vielen Eppi-Röhrchen immer von neuem und kühlt sie wieder ab. Daher die Bezeichnung PCR-Cycler. Bei jedem Zyklus wird also ein einzelner RNA-Strang für das erneute Abkopieren wieder thermisch aufgespaltet und mittels Kombination aus Primer, Polymerase -Enzym und Nukleotiden wieder zur „doppelten Strickleiter“ ergänzt usw.
Dadurch werden die Covid 19-Gena vermehrt und zwar um etliche Potenzen höher als die sonstigen im Röhrchen befindlichen RNA-Stücke.

Bei diesen Zyklen wird gleichzeitig ein Farbstoff freigesetzt, der in gebundener Form ebenfalls in der Mixtur enthalten ist. Sensoren im Automaten messen nach jedem Durchlauf die Einfärbung und wenn ein bestimmte Schwelle erreicht ist, gilt dies als Nachweis für die Virus-RNA.

Nach spätestens 30-40 Zyklen wird der Prozess gestoppt: Sollte bis dahin keine Flousreszenz erkennbar sein, ist auch keine Virus-RNA im Röhrchen enthalten.

Als die PCR in den 80er-Jahren entwickelt wurde, musste jeder der hier automatisch ablaufenden Schritte manuell ausgeführt werden. Am Ende wurde die Probe dann noch angefärbt, um die evtl. Vervielfältigung der gesuchten RNA zu messen. Liegt ein „Positiv“-Probe vor, nimmt die Stärke der Fluoreszenz ab einer bestimmt Zyklenzahl exponentiell zu.

Test-Resultat

Das Test-Resultat wird in einer Datenbank gespeichert auf die der Patient z.B. über den bei der Probenentnahme erhaltenen QR-Code Zugriff hat.

Archivierung Zellprobe und Test-Resultat

Die Zellproben selbst werden idR. nicht aufgehoben. Dies ist nicht nötig und wäre bei Milliionen Tests jeden Tag auch kaum praktikabel.

Die Test-Resultate hingegen sind in Datenbanken gespeichert, somit also späer nachvollziebar. Sie sind wichtige Quelle für Entscheidungen der Infektinosschutzbehörden über z.B. einen erfordelrichen Lockdown.

»» Startbeitrag „Life Science“ mit Übersicht

Schreibe einen Kommentar

Deine E-Mail-Adresse wird nicht veröffentlicht. Erforderliche Felder sind mit * markiert.

Diese Website verwendet Akismet, um Spam zu reduzieren. Erfahre mehr darüber, wie deine Kommentardaten verarbeitet werden.